یک روش پیش آب و ماسه اصلاح شده برای جداسازی سلولهای بنیادی عضلانی با بازده بالا و با خلوص بالا از بافت عضلات اسکلتی انسان/موش

Kiyoshi Yoshioka 1 ، Yasuo Kitajima 1 ،Narihiro Okazaki 2 , Ko Chiba 2 , Akihiko Yonekura 2 and Yusuke Ono 1*

• 1 گروه توسعه و بازسازی عضلات ، انستیتوی جنین شناسی مولکولی و ژنتیک ، دانشگاه کوماموتو ، کوماموتو ، ژاپن
• 2 گروه جراحی ارتوپدی ، دانشکده فارغ التحصیل علوم زیست پزشکی دانشگاه ناگازاکی ، ناگازاکی ، ژاپن

کشت اولیه سلولهای بنیادی عضلانی اسکلتی (MUSC) برای مطالعه پویایی بازسازی عضلات و هموستاز ضروری است. در اینجا ما روش پیش آب و ماسه اصلاح شده را برای جداسازی MUSC در فرهنگ با خلوص ، عملکرد و زمان بسیار بهبود یافته توصیف می کنیم. این پروتکل بر اساس خصوصیات چسبندگی متمایز MUSC ها ساخته شده است. ما زمان روش را به 2. 5 روز کاهش دادیم تا از طریق یک مرحله جدید زغال سنگ جدید که به تازگی کار می کنند ، جوجه کشی و تعلیق سلول را تکرار کنیم. مرحله پس انداز مجدد به طور مؤثر سلولهای فیبروبلاستیک باقیمانده ، اما نه MUSCS را بر روی یک ظرف پوشیده از کلاژن به دام می اندازد. علاوه بر این ، ما تأیید کردیم که MUSC ها را می توان از مقادیر کمی از بافت های عضلانی انسان/موش جدا کرد و ما را قادر می سازد تا آزمایشاتی را با نمونه های محدود به میزان انجام دهیم. بنابراین ، روش ما می تواند با تجهیزات آزمایشگاهی اساسی مناسب برای اکثر امکانات و بدون تکنیک های پیشرفته کنترل MUSC انجام شود.

معرفی

سلولهای بنیادی عضلانی اسکلتی بزرگسالان (MUSCS) ، همچنین به عنوان سلولهای ماهواره ای عضلانی شناخته می شوند ، سلولهای بنیادی بافت ساکن واقع در بین لایه پایه و پلاسمالمی میوفیبرها هستند (مائورو ، 1961). Muscs نقش مهمی در رشد عضلات ، ترمیم هیپرتروفی و بازسازی در بزرگسالان ایفا می کند (Sacco et al. ، 2008 ؛ Relaix and Zammit ، 2012 ؛ Yin et al. ، 2013 ؛ Coelison ، 2018 ؛ Kitajima et al. ، 2018). میوژنز پس از زایمان مستلزم فعال سازی سلول ماهواره ای ساکن ، تکوبلاست (سلولهای ماهواره ای فعال) و تلفیق میوبلاست ها به الیاف چند هسته ای است (مورگان و پارتریج ، 2003). میوژنز یک فرآیند پیچیده است که توسط فاکتورهای رونویسی ، از جمله عوامل نظارتی میوژنیک (MRF) تنظیم می شود (پارکر و همکاران ، 2003 ؛ Wagers and Conboy ، 2005 ؛ Braun and Gautel ، 2011). Muscs برای هموستاز عضلانی اسکلتی و بازسازی در طول زندگی ضروری است (بلو و همکاران ، 2015). بنابراین ، درک پویایی MUSC ها می تواند بینش ارزشمندی در مورد مکانیسم های دژنراسیون عضلات در بیماری و پیری فراهم کند.

مرتب سازی سلولهای فعال شده با فلورسانس (FACS) روشی به خوبی تثبیت شده است که به طور گسترده برای جداسازی MUSC ها مورد استفاده قرار گرفته است. این روش معمولاً شامل هضم آنزیمی و به دنبال آن رنگ آمیزی آنتی بادی برای نشانگرهای خاص MUSC (به عنوان مثال ، α7-integrin ، VCAM1 ، CD34 و CD82) و نشانگرهای منفی (به عنوان مثال ، CD31 ، CD45 و SCA1) (Montarras et al. ، 2005 ؛Fukada et al. ، 2007 ؛ Joe et al. ، 2010 ؛ Liu et al. ، 2013 ؛ Alexander et al. ، 2016 ؛ Kitajima et al. ، 2016 ؛ Uezumi et al. ، 2016). مرتب سازی سلولهای مغناطیسی یک روش متناوب برای جدا کردن موس است. همچنین به مراحل برچسب زدن سلول با نشانگرهای سطح خاص نیاز دارد (Motohashi et al. ، 2014). به تازگی ، ما یک خط ماوس Knock-in PAX7-YFP ایجاد کردیم که می تواند به طور مستقیم در FACS بدون سیستم ایمنی پس از هضم آنزیمی اعمال شود (Kitajima and Ono ، 2018). با این حال ، آسیب سلولی در هنگام مرتب سازی سلول با توجه به ماهیت روش غیرقابل اجتناب است: قرار گرفتن در معرض فشار ، ولتاژ و قطرات حاوی سلول که به سطح مایع حمله می کنند. این خسارت ها استرس سلولی ناشی از Sorter (SICS) نامیده می شوند (Lopez and Hulspas ، 2020). SICS باعث مرگ سلولی ، نقص تکثیر کننده می شود و به طور بالقوه بر فنوتیپ های سلولی تأثیر می گذارد (آندرو و همکاران ، 2020). همچنین گزارش شده است که برخی از پروتئین های فلورسانس خود می توانند برای سلول ها سمی باشند (لیو و همکاران ، 1999). با توجه به این محدودیت ها ، محققان ممکن است در هنگام مرتب سازی سلول ، از بین رفتن سلول غیر عمدی را تجربه کنند.

در اینجا ، ما یک تکنیک از پیش آب و هوایی را ایجاد کردیم که با اضافه کردن مراحل پس انداز مجدد ، باعث افزایش عملکرد بالا و جداسازی MUSC با خلوص بالا می شود. ما با موفقیت از 20 میلی گرم بافت عضلانی انسان با استفاده از این پروتکل با موفقیت MUSCS را جدا کرده ایم. پروتکل جدید ما برای به دست آوردن MUSCS از نمونه های محدود به مقدار ایده آل است. کل فرآیند به 2. 5 روز نیاز دارد ، در حالی که سایر روشهای پیش از آب و پیاز به طور معمول برای به دست آوردن عضلات خالص از عضلات پا به روزهای بیشتری نیاز دارند ، یا نیاز به گسترش کامل سلول ها از قبل برای تصفیه دارند (Qu et al. ، 1998 ؛ Jankowski et al. ، 2001؛ پارک و همکاران ، 2006 ؛ غرابه و همکاران ، 2008 ؛ زو و همکاران ، 2018). سرانجام ، این تکنیک نیازی به تجهیزات گران قیمت یا آنتی بادی ندارد. بنابراین ، این تکنیک به طور گسترده ای در دسترس است و ممکن است منجر به پیشرفت بیشتر در تحقیقات عضلات اسکلتی شود.

مواد و روش ها

آماده سازی عضلات و تفکیک آنزیمی

عضله جدا شد و در نمک بافر فسفات (PBS) جمع آوری و جمع آوری شد. عضله در یک ظرف جدید پتری حاوی PBS قرار گرفت. تمام دستکاری های بعدی در یک هود فرهنگ انجام می شود. هرگونه ذخایر چربی و عصبی قابل مشاهده با فورسپس برداشته شد. عضله روی یک صفحه پلاستیکی قرار داده شده و بافت را با قیچی جراحی کوچک در خمیر خرد کرده است تا هیچ رسوب عضلانی قابل مشاهده باقی نماند. خمیر به یک لوله حاوی 0. 2 ٪ کلاژناز نوع II (LS004177 ، Worthington Biochemical ، Freehold ، NJ ، ایالات متحده) در DMEM (محیط اصلاح شده Eagle Dulbecco ، C11995500 ، Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، United ، ایالات متحده) منتقل شد. 1٪ پنی سیلین استرپتومایسین (PS ، 168-23191 ، Wako ، اوزاکا ، ژاپن). تقریباً 3 میلی لیتر محلول کلاژناز برای 1 گرم بافت عضلانی ∗∗ تهیه شد. خمیر در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 60 دقیقه روی یک شاکر انکوبه شد. بافت عضلانی خرد شده را از طریق سوزن سرنگ 20 گرم چندین بار عبور دهید. در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انکوبه کنید. هموژنات با یک سوزن سرنگ 20 گرم جمع آوری و با 40 میلی لیتر PBS حل شد ، سپس با استفاده از صاف کننده مش نایلون 40 میکرومتر فیلتر شد. جریان از طریق یک لوله مخروطی 50 میلی لیتری جمع آوری و در 500 × گرم به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. این مایع رویی دور ریخته شد و سلول ها در محیط رشد **** (GM ، 30 ٪ سرم گاوی جنین (FBS) ، 1 ٪ عصاره جنین جوجه (CEE ، C3999 ، USBiological ، Swampscott ، MA ، ایالات متحده) ، 10 نانومتر به حالت تعلیق درآمد./میلی لیتر فاکتور رشد فیبروبلاست اساسی (BFGF) و 1 ٪ PS در DMEM) (خلاصه شده در شکل 1A).

شکل 1

شکل 1. نمودار شماتیک از روش پیش آب و هوای اصلاح شده.(الف) نمودار شماتیک که در روش ها به تفصیل است.( B-D) تصاویر نماینده برای سلولهای جدا شده از عضلات اندام تحتانی موش. میله های مقیاس = 100 میکرومتر.(ب) یک تصویر نماینده از سلولهای متصل در روکش کلاژن که برای اولین بار از قبل و کمیت آن استفاده می شود. سلولها با Pax7 (سبز) ، myod (قرمز) و DAPI (آبی) رنگ آمیزی شدند. تصاویر با تصاویر فاز کنتراست (PH) نوار خطا = SD ، N = 4. (C ، D) تصاویر نماینده سلولهای پیوست شده در کاشت های روکش شده با کلاژن مورد استفاده برای مرحله زغال سنگ مجدد (C) و سلولهای خالص شده ادغام شدند (D).(ه) اندازه گیری سلولهای رنگ آمیزی شده برای نشانگرهای MUSC (PAX7 و MYOD) یا نشانگرهای غیر MUSC (NG2 ، PDGFRα و PDGFRβ). میله های خطا = SD ، n = 4 ، ∗∗∗ p<0.001, ∗∗∗∗ p <0.0001.

پیش رو به رشد ، گسترش سلول و گلدان مجدد

GM حاوی سلول به یک ظرف پوشیده از کلاژن نوع I منتقل شد و در یک شبانه (16 ساعت) در یک انکوباتور از پیش روکش شده بود. روز بعد ، جنرال موتورز حاوی سلول بر روی ظرف قرار گرفت تا سلولهای بدون اتصال را به حالت تعلیق درآورد. محلول از ظرف به یک ظرف جدید پوشیده از کلاژن نوع I منتقل شد و به مدت 3 ساعت در یک انکوباتور از قبل روکش شده بود. محلول به مدت 24 ساعت به یک صفحه پوشش داده شده با ماتریگل (356234 ، کورنینگ ، کورنینگ ، نیویورک ، ایالات متحده) منتقل شد. رسانه ها به حالت تعلیق درآمدها ، از رسانه ها استفاده شدند ، سپس رسانه ها را با جنرال موتورز تازه جایگزین و به مدت 24 ساعت انکوبه کردند. سلولهای گسترش یافته با تریپسین-EDTA (0. 25 ٪ ، 25200072 ، Thermo Fisher Scientific) جدا شدند. سلولها با PBS شسته شدند ، سانتریفیوژ شدند و در GM # مجدداً تعلیق شدند. جنرال موتورز حاوی سلول به یک غذای با روکش کلاژن نوع I (4010-010 ، ایواکی ، توکیو ، ژاپن) منتقل شد. ظرف به مدت 5 دقیقه انکوبه شد و سپس به آرامی متزلزل شد تا سلولهای بدون اتصال را به حالت تعلیق درآورد. مرحله انکوبات و لرزش 5 بار ### تکرار شد. محلول به یک صفحه پوشیده از ماتریگل منتقل شد (خلاصه در شکل 1A).

نکات

*MINCING کامل باعث افزایش عملکرد سلولهای ماهواره ای می شود.** از آنجا که این روش جمع آوری سلول را از مقادیر کمی از بافت امکان پذیر می کند ، ما معمولاً از 300 میکرولیتر از محلول کلاژناز 0. 2 ٪ برای قدامی تیبیالیس موش (TA) (تقریباً 50 میلی گرم × 2 ، هر دو طرف پاها) استفاده می کنیم.*** جوجه کشی بیش از حد به سلول ها آسیب می رساند. اگر دوغاب یکنواخت در این مرحله از سوزن سرنگ 20 گرم عبور کند ، جوجه کشی بیشتر لازم نیست.**** مقدار کافی از جنرال موتورز را برای پوشاندن غذاهای پوشیده از کلاژن نوع I اضافه کنید. برای دو عضله موش TA ، 4 میلی لیتر GM را برای 60 میلی متر ترشی اضافه کنید. برای عضلات کامل پا (تقریبا 1. 5 گرم) ، 7 میلی لیتر GM را برای یک عدد 100 میلی متر اضافه کنید.# به ظروف شکافت ، مقدار جنرال موتورز باید به طور مناسب کاهش یابد.## فیبروبلاستها در مدت 5 دقیقه شروع به اتصال به پایین ظرف پوشیده از کلاژن می کنند. بیش از 5 دقیقه ظرف را انکوبه نکنید. پس از 5 دقیقه ، MUSC ها شروع به چسبیدن به قسمت پایین ظرف می کنند و جوجه کشی طولانی تر باعث کاهش عملکرد به دلیل انتقال ناکارآمد MUSC در بخش بعدی می شود.### مرحله انکوبات و لرزش ، تصفیه بیشتر موک ها را امکان پذیر می کند. اگر فیبروبلاستها در این مرحله باقی بمانند ، مراحل اضافی انکوبات و لرزش توصیه می شود.

مصونیت برای اعتبار سنجی

ایمونوسیتوشیمی همانطور که قبلاً توضیح داده شد بر روی سلولهای ماهواره ای انجام شد (Kitajima و همکاران ، 2016). به طور خلاصه ، نمونه ها با PFA ثابت شدند و با آنتی بادی های اولیه در 4 درجه سانتیگراد یک شبه به دنبال مسدود کردن/نفوذپذیری با PBS با 0. 3 ٪ سرم Triton X-100 و 5 ٪ سرم بز به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق (RT) انکوبه شدند. تمام نمونه های ایمنی با استفاده از گونه های مناسب Alexa Fluor 488 و/یا 546 آنتی بادی های ثانویه فلورسنت کونژوگه شده (فناوری های زندگی ، کارلسباد ، کالیفرنیا ، ایالات متحده) تجسم شد. نمونه ها در محیط نصب حاوی 4،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) برای رنگ آمیزی هسته ای ، خریداری شده از Nakalai Tesque (کیوتو ، ژاپن) نصب شدند. نمونه ها با میکروسکوپ فلورسانس Olympus IX83 (Olympus ، توکیو ، ژاپن) یا Cellinsight CX5 (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، ایالات متحده) مشاهده شد. از آنتی بادی های اولیه زیر استفاده شد: موش ضد PAX7 (SC-81648 ، مورد استفاده در رقیق 1: 500) و ضد میود خرگوش (SC-760 ، مورد استفاده در 1: 1000 رقیق) آنتی بادی ها از بیوتکنولوژی سانتا کروز خریداری شد (سانتا کروز، کالیفرنیا ، ایالات متحده). آنتی بادی ضد MYHC موش (MF20 ، MAB4470 ، مورد استفاده در رقیق 1: 1000) از سیستم های تحقیق و توسعه (مینیاپولیس ، MN ، ایالات متحده) خریداری شد. آنتی بادی پروتئوگلیکان پروتئیگلیکان سولفات ضد NG2 خرگوش (AB5320 ، که در رقیق 1: 250 استفاده می شود) از EMD Millipore (Burlington ، MA ، ایالات متحده) خریداری شد. آنتی بادی ضد CD140B (PDGFRβ) موش (14-1402-82 ، مورد استفاده در رقت 1: 250) از ترمو فیشر علمی (Waltham ، MA ، ایالات متحده) خریداری شد. آنتی بادی ضد CD140A (PDGFRα) موش (135901 ، مورد استفاده در رقیق 1: 250) از Biolegend (سن دیگو ، کالیفرنیا ، ایالات متحده) خریداری شد.

بافت عضلانی

بافتهای عضلانی اسکلتی مورد استفاده در مطالعه حاضر ، semitendinosus انسانی (ST) و موش TA بودند. ST انسان از بیمارانی که تحت عمل جراحی بازسازی به دنبال پارگی رباط صلیبی قدامی جمع آوری شدند. موش TA از موش C57BL/6J جمع آوری شد.

ایجاد تمایز

برای بررسی پتانسیل تشکیل میوتوب سلولهای جدا شده ، تمایز عضلات روی یک ظرف پوشیده از ماتریگل ایجاد شد. سلولها با GM گسترش یافتند و سپس با محیط تمایز (DM ، 5 ٪ سرم اسب و 1 ٪ PS در DMEM) کشت شدند.

تحلیل آماری

برای مقایسه آماری دو شرط ، t-test بدون زوج ، دو دم ، t-test با استفاده از PraphPad Prism (نسخه 8) انجام شد. برای همه آزمایشات آماری ، ص<0.05 was regarded as statistically significant. All error bars represent standard deviations.

بیان اخلاق

کمیته آزمایش و استفاده از حیوانات دانشگاه دانشگاه ناگازاکی و دانشگاه کوماموتو تمام آزمایش حیوانات را تصویب کردند (شماره 1203190970 و A30-098). استفاده از نمونه های بافت انسانی توسط کمیته اخلاق دانشگاه ناگازاکی تأیید شد (شماره شماره 16052306).

نتایج و بحث

مرتب سازی کارآمد MUSC برای بررسی بازسازی عضلات اسکلتی و هموستاز در هر دو علوم پایه و کاربردهای ترجمه ضروری است. این مطالعه روش جدیدی را برای جداسازی MUSC با استفاده از تجهیزات اساسی آزمایشگاهی ارائه می دهد. این روش برای تصفیه تعداد فراوان میوبلاست مثبت برای Pax7 و/یا MyOD ، زمان روش را به 2. 5 روز کاهش می دهد (شکل 1 C-E). در واقع ، مهمترین مزیت این روش "سادگی و زمان" است. اگرچه سلولهای به دست آمده جمعیت محدودی با پتانسیل کم پیوست هستند ، اما می تواند یکی از گزینه های جداسازی سلولهای میوژنیک علاوه بر روشهای مرتب سازی سلول های دارای آنتی بادی باشد.

تکنیک پیش از صفحه مبتنی بر تفاوت در خصوصیات چسبندگی سلولهای فیبروبلاستیک و موک ها است (ریچلر و یاف ، 1970 ؛ راندو و بلو ، 1994). در اولین مرحله قبل از آب وبر ، بیشتر فیبروبلاست ها روی ظرف پوشیده از کلاژن به دام می افتند (شکل 1B). پس از 2 روز گسترش سلول در GM ، فیبروبلاستها هنوز هم می توانند مشاهده شوند. برای تصفیه بیشتر MUSC ها ، ما مرحله پس انداز اضافی را انجام می دهیم. در این مرحله ، بیشتر MUSC ها تحت تحریک GM فعال می شوند و در مقایسه با MUSC های ساکن بسیار چسبنده تر می شوند. در مرحله پس انداز مجدد ، تله های پنج دقیقه ای با انکوباسیون سلولهای چسبنده به طور عمده از جمعیت سلولی غیر ماهواره ای از جمله فیبروبلاستها ، پریتیتها/مزانژیولاست ها ، و فرزندان مزانشیمی ، مثبت برای NG2 ، PDGFRα و/یا PDGFβ (شکل 1C ؛ Uezumi ets تشکیل شده است. آل. ، 2010 ؛ جودسون و همکاران ، 2013).

این پروتکل می تواند در 2. 5 روز موک های خالص شده را جدا کند. بر خلاف رده های سلولی (به عنوان مثال ، C2C12 و L6) ، MUSC های کشت شده اولیه قادر به تمایز ، بیان نشانگرهای تمایز و همجوشی با یکدیگر در روزهای طولانی کشت ، حتی در GM هستند. در اینجا ، ما کل فرایند را با استفاده از مرحله پس انداز مجدد کوتاه کردیم و برنامه های آزمایشی را قادر می سازیم تا تکثیر MUSC را با کاهش تأثیر تمایز خود آزمایش کنیم.

تکنیک پیش از صفحه بیش از یک دهه استفاده شده است (غرابه و همکاران ، 2008) و در سالهای اخیر بهبود یافته است (Xu et al. ، 2018). بسیاری از تکنیک های پیش از صفحه ، از جمله آنهایی که دارای اصلاح هستند ، قبلاً در آزمایشگاه ها استفاده می شود. با توجه به سایر روشهای پیش از آبگیری موجود (Arsic et al. ، 2008 ؛ Gharaibeh et al. ، 2008 ؛ Li et al. ، 2010 ؛ Xu et al. ، 2018) ، روش ما نیازی به تکمیل تصفیه MUSC نداردقرار گرفتن در معرض سلول اولیه در محیط رشد (GM) ، که در آن سلول ها اغلب از بین می روند. در روش ما ، ابتدا muscs قابل گسترش است و سپس در مرحله پس انداز مجدد خالص می شود. این روشها حتی از مقدار کمی از بافتهای عضلانی ، کسب MUSC را تضمین می کند. مرحله پس انداز مجدد را نیز می توان در عضلات فعال و تکثیر درج کرد. بر این اساس ، از روش ما به عنوان "افزودنی" برای هر روش پیش آب و برق استفاده می شود. این رویکرد برای هر دو تکنیک قبل از آبکاری و تکنیک های تک فیبر کاربرد دارد (Ono et al. ، 2012) که در آن آلودگی فیبروبلاست آزمایشات را پس از مهاجرت به عضلات به پایین ظرف مانع می کند.

پروتکل شرح داده شده در اینجا برای انواع مختلف عضلات اسکلتی انسان یا موش کاربرد دارد. ما تأیید کردیم که MUSC های خالص قادر به تمایز میوژنیک به اندازه سلولهای طبقه بندی شده FACS (Kitajima and Ono ، 2018) در معرض DM قرار گرفتند (شکل 2A ، B). به غیر از بافتهای TA انسان و موش TA ، ما همچنین MUSC های جدا شده از Buccinator و Masseter افراد انسانی را جدا کرده ایم ، و ماساژور ، Trapezius ، Supraspinatus ، Triceps ، Gastrocnemius ، Bulbospongiosus و Levator Ani of C57BL/6J موش ، با استفاده از این روش (این روش (داده ها نشان داده نشده است). از آنجا که این پروتکل می تواند صدف را از مقادیر کمی از عضلات جدا کند ، می توان از آن استفاده کرد ، به عنوان مثال ، برای بررسی تفاوت بین عضلات سریع گلیکولیتیک و عضلات اکسیداتیو آهسته که حجم عضلات به دست آمده از یک موش واحد محدود است.

شکل 2

شکل 2. تأیید خلوص.(الف) تصاویر نماینده از MUSC های خالص کشت شده در GM و کمیت سلولهای Pax7 یا MyOD مثبت. سلولهای ماوس TA یا ST انسان با Pax7 (سبز) ، MyOD (قرمز) و DAPI (آبی) مصون شدند. n = 4 هر یک ، میله های مقیاس = 100 میکرومتر ، میله های خطا = SD.(ب) تصاویر نماینده از موک های خالص کشت شده در GM و DM. سلولهایی از عضلات TA ماوس یا ST انسان برای MF20 (سبز) همراه با رنگ آمیزی DAPI (آبی) مصون شدند. پس از رسیدن سلولهای انسانی به تلاقی ، سلولها به مدت 48 ساعت به تمایز در DM القا شدند.

حالت ساکن سلولهای ماهواره ای یک کلید برای حفظ عملکرد سلول بنیادی برای گسترش جمعیت در داخل بدن هنگام پیوند در عضلات گیرنده است (کالینز و همکاران ، 2005). اگرچه روش پیش آب و هوای اصلاح شده ما برای به دست آوردن muscs از مقدار محدودی از بیوپسی از بیماران مفید است ، اما در هنگام انزوا ، ترک سلولی ماهواره ای را می شکند. با این حال ، روش ما ممکن است برای درمان سلول برای درمان بیماری های عضلانی با ترکیب با تکنیک های نوظهور کنترل عمق ترک سلولی کاربرد داشته باشد (گیلبرت و همکاران ، 2010 ؛ کوون و همکاران ، 2017 ؛ فوجیماکی و همکاران ، 2019). علاوه بر این ، روش ما نیز ممکن است برای اعتبارسنجی سلولهای عضلانی به دست آمده از سلولهای IPS اعمال شود.

طبقه بندی FACS روشی به خوبی تثبیت شده برای جدا کردن Muscs است. با این حال ، روش ما با توجه به سادگی و عدم آسیب سلولی که منجر به عملکرد بالاتر می شود ، مزایایی دارد. روش ما می تواند یکی از گزینه های جداسازی سلولهای میوژنیک علاوه بر روشهای مرتب سازی سلول با آنتی بادی باشد.

انتخاب برنامه آزمایشی مناسب باعث تسریع در تحقیقات می شود ، و روش اصلاح شده قبل از آب بخشیدن می تواند جایگزینی برای MACS برای جداسازی MUSC ها در برخی موارد آزمایشی باشد.

نتیجه

این پروتکل با استفاده از تجهیزات آزمایشگاهی اساسی که به راحتی در دسترس است ، جداسازی MUSC را از بافت عضلانی اسکلتی انسان/موش امکان پذیر می کند. علاوه بر این ، انزوا MUSC با عملکرد سریع و بالا به دست آمده در اینجا به ما امکان می دهد تا کاربردهای تجربی بیشتری را برای بررسی بازسازی عضلات انجام دهیم. ما معتقدیم که این روش یک رویکرد کارآمد برای جدا کردن MUSC ها از نظر عملکرد سلول ، سادگی و مقرون به صرفه بودن ، جامعه علمی را فراهم می کند.

بیانیه در دسترس بودن داده ها

مجموعه داده های تولید شده برای این مطالعه به درخواست نویسنده مربوطه در دسترس است.

بیان اخلاق

مطالعات مربوط به شرکت کنندگان انسانی توسط کمیته اخلاق تحقیقات بالینی بیمارستان دانشگاه ناگازاکی مورد بررسی و تأیید قرار گرفت. رضایت آگاهانه کتبی برای شرکت در این مطالعه توسط سرپرست قانونی شرکت کنندگان/بعدی خویشاوندان ارائه شده است. مطالعه حیوانات توسط کمیته آزمایش و استفاده از حیوانات تجربی دانشگاه کوماموتو مورد بررسی و تأیید قرار گرفت.

کمک های نویسنده

KY آزمایش ها را تصور، طراحی و اجرا کرد، ارقام را جمع آوری کرد، داده ها را تجزیه و تحلیل کرد و دست نوشته را نوشت. YK آزمایش ها را انجام داد، داده ها را تجزیه و تحلیل کرد و دستنوشته را نوشت. NO، KC و AY ابزارهای تحلیلی ارائه کردند و پشتیبانی فنی ارائه کردند. YO آزمایش ها را طراحی کرد، داده ها را جمع آوری کرد و دستنوشته را نوشت. همه نویسندگان نتایج را مورد بحث و بررسی قرار دادند و در مورد مقاله نظر دادند.

منابع مالی

این کار توسط آژانس تحقیقات و توسعه پزشکی ژاپن (AMED, 16bm0704010h0001, 18ek0109383h0001, and 19bm0704036h0001) و Grantin-Aid for Scientific Research KAKENHI (18H031919, 18, 18, 00, 00, 00, 00, 00, 000, 18H03, 00, 00, 18, 18, 00, 00, 000, 18, 18, 19, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 10, 10, 10, 00, 10, 11, 00, 10, 00, 00, 00, 00, 00, 000) 19711). این کار همچنین تا حدی توسط بنیاد علمی تاکدا حمایت شد. این کار تا حدی در هسته تحقیقاتی بین المللی برای پزشکی رشد مبتنی بر سلول های بنیادی (دانشگاه کوماموتو) انجام شد. مرکز تنظیم متابولیک پیری سالم (دانشگاه کوماموتو).

تضاد منافع

نویسندگان اعلام می کنند که این تحقیق در غیاب هر گونه روابط تجاری یا مالی که می تواند به عنوان تضاد منافع بالقوه تعبیر شود، انجام شده است.

قدردانی

ما از همه اعضای آزمایشگاه Ono برای پشتیبانی فنی تشکر می کنیم.

منابع

الکساندر، ام. اس.، رزکالن، ا.، کولتا، ا.، اسپینازولا، جی. ام.، جانسون، اس.، رحیموف، اف.، و همکاران.(2016). CD82 یک نشانگر برای جداسازی آینده نگر سلول های ماهواره ای ماهیچه ای انسان است و با دیستروفی عضلانی مرتبط است. سلول بنیادی سلولی 19، 800-807. doi: 10. 1016/j. stem. 2016. 08. 006

Andrä, I., Ulrich, H., Dürr, S., Soll, D., Henkel, L., Angerpointner, C., et al.(2020). ارزیابی عملکرد سلول T پس از مرتب سازی فلوسیتومتری، فعال سازی MAPK p38 را نشان داد. سیتوم. قسمت A 97, 171-183. doi: 10. 1002/cyto. a. 23964

Arsic, N., Mamaeva, D., Lamb, N. J., and Feandez, A. (2008). سلول های بنیادی مشتق از عضله جدا شده به عنوان جمعیت غیر چسبنده باعث ایجاد دودمان قلبی، عضله اسکلتی و عصبی می شود. انقضاCell Res. 314، 1266-1280. doi: 10. 1016/j. yexcr. 2008. 01. 009

Blau، H. M.، Cosgrove، B. D. و Ho، A. T. V. (2015). نقش مرکزی سلول های بنیادی عضلانی در شکست بازسازی با افزایش سننات. پزشکی21، 854-862. doi: 10. 1038/nm. 3918

براون، تی، و گوتل، ام. (2011). مکانیسم های رونویسی تنظیم کننده تمایز عضلات اسکلتی، رشد و هموستاز. نات. کشیش مول. سلول بیول. 12، 349-361. doi: 10. 1038/nrm3118

Collins، C. A.، Olsen، I.، Zammit، P. S.، Heslop، L.، Petrie، A.، Partridge، T. A.، و همکاران.(2005). عملکرد سلول های بنیادی، خود نوسازی و ناهمگونی رفتاری سلول ها از طاقچه سلول های ماهواره ای ماهیچه ای بالغ. سلول 122، 289-301. doi: 10. 1016/j. cell. 2005. 05. 010

کورنلیسون، دی (2018)."ناشناخته های شناخته شده": سوالات فعلی در زیست شناسی سلولی ماهواره ای ماهیچه ای. کر. بالا. توسعه دهندهBiol. 126، 205-233. doi: 10. 1016/bs. ctdb. 2017. 08. 006

فوجیماکی، ک.، لی، آر.، چن، اچ.، کروسه، ک.، دلا، او.، ژانگ، اچ. اچ، و همکاران.(2019). تنظیم درجه بندی عمق سکون سلولی بین تکثیر و پیری توسط سوئیچ دیمر لیزوزومی. Proc. Natl. آکادمیعلمیU. S. A. 116, 22624 22634. doi: 10. 1073/pnas. 1915905116

Fukada، S.، Uezumi، A.، Ikemoto، M.، Masuda، S.، Segawa، M.، Tanimura، N.، و همکاران.(2007). امضای مولکولی سلول های ماهواره ای ساکن در عضله اسکلتی بالغسلول های بنیادی 25، 2448-2459. doi: 10. 1634/stemcells. 2007-2019

Gharaibeh, B., Lu, A., Tebbets, J., Zheng, B., Feduska, J., Crisan, M., et al.(2008). جداسازی بخش سلولی با چسبندگی آهسته حاوی سلول های بنیادی از عضله اسکلتی موش با تکنیک preplate. نات. پروتکل3، 1501-1509. doi: 10. 1038/nprot. 2008. 142

گیلبرت، پی. ام.، هاونسترایت، ک. ال.، مگنوسون، ک. ای. جی.، ساکو، آ.، لئوناردی، ان. ا.، کرافت، پی، و همکاران.(2010). خاصیت ارتجاعی بستر، خود نوسازی سلول های بنیادی ماهیچه های اسکلتی را در کشت تنظیم می کند. علوم 329، 1078-1081. doi: 10. 1126/science. 1191035

Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., and Huard, J. (2001). خصوصیات فلوسایتومتری جمعیت های سلولی میوژنیک به دست آمده از طریق تکنیک preplate: پتانسیل برای جداسازی سریع سلول های بنیادی مشتق شده از عضله. هومژن وجود دارد. 12، 619-628. doi: 10. 1089/104303401300057306

جو، A. W. B.، یی، L.، Natarajan، A.، Le Grand، F.، So، L.، وانگ، J.، و همکاران.(2010). آسیب عضلانی پیش سازهای فیبرو/چربی زایی ساکن را فعال می کند که میوژنز را تسهیل می کند. نات. سلول بیول. 12، 153-163. doi: 10. 1038/ncb2015

Judson، R. N.، Zhang، R.-H.، و Rossi، F. M. A. (2013). سلول های بنیادی/پیش ساز مزانشیمی ساکن بافت در عضله اسکلتی: همکاران یا خرابکاران؟FEBS J. 280، 4100-4108. doi: 10. 1111/febs. 12370

Kitajima، Y.، Ogawa، S.، و Ono، Y. (2016). تجسم ناهمگنی عملکردی سلول های بنیادی عضلانی. روش ها مول. Biol. 1516، 183-193. doi: 10. 1007/7651_2016_349

Kitajima، Y.، و Ono، Y. (2018). تجسم دینامیک پروتئین PAX7 در سلول های ماهواره ای عضلانی در خط ضربه ای در موش YFP. اسکلت. عضله 8:26. doi: 10. 1186/s13395-018-0174-x

Kitajima، Y.، Suzuki، N.، Nunomiya، A.، Osana، S.، Yoshioka، K.، Tashiro، Y.، و همکاران.(2018). سیستم یوبیکوئیتین-پروتئازوم برای نگهداری سلول های بنیادی ماهیچه ای ضروری است. سلول های بنیادی 11، 1523-1538. doi: 10. 1016/j. stemcr. 2018. 10. 009

Kwon, J. S., Everetts, N. J., Wang, X., Wang, W., Della Croce, K., Xing, J., et al.(2017). کنترل عمق سکون سلولی توسط سوئیچ شبکه Rb-E2F. Cell Rep. 20, 3223-3235. doi: 10. 1016/j. celrep. 2017. 09. 007

لی، ی.، پان، اچ، و هارد، جی (2010). جداسازی سلول های بنیادی از بافت های اسکلتی عضلانی نرمJ. Vis. انقضا5:2011. doi: 10. 3791/2011

لیو، H.-S.، Jan، M.-S.، Chou، C.-K.، Chen، P.-H.، و Ke، N.-J.(1999). آیا پروتئین فلورسنت سبز برای سلول های زنده سمی است؟بیوشیمی. بیوفیز. Res. اشتراک. 260، 712-717. doi: 10. 1006/bbrc. 1999. 0954

لیو، ال.، چئونگ، تی. اچ.، چارویل، جی. دبلیو.، هورگو، بی. ام. سی.، لیویت، تی، شی، جی، و همکاران.(2013). تغییرات کروماتین به عنوان عوامل تعیین کننده سکون سلول های بنیادی عضلانی و پیری زمانیCell Rep. 4, 189-204. doi: 10. 1016/j. celrep. 2013. 05. 043

لوپز، پی. ا.، و هولسپاس، آر. (2020). موضوع ویژه در مورد افزایش تکرارپذیری و دقت. سیتوم. قسمت الف 97، 105 106. doi: 10. 1002/cyto. a. 23972

Mauro، A. (1961). سلول ماهواره ای فیبرهای عضلانی اسکلتی. J. Biophys. بیوشیمی. سیتول. 9، 493-495. doi: 10. 1083/jcb. 9. 2. 493

Montarras, D., Morgan, J., Colins, C., Relaix, F., Zaffran, S., Cumano, A., et al.(2005). زیست شناسی رشد: جداسازی مستقیم سلول های ماهواره ای برای بازسازی عضلات اسکلتیScience 309، 2064-2067. doi: 10. 1126/science. 1114758

مورگان، جی ای.، و پارتریج، تی آ (2003). سلول های ماهواره ای عضلانیبین المللیجی بیوشیم. سلول بیول. 35، 1151-1156. doi: 10. 1016/S1357-2725(03)00042-46

Motohashi, N., Asakura, Y., and Asakura, A. (2014). جداسازی، کشت و پیوند سلول های ماهواره ای ماهیچه ای. J. Vis. انقضا86:e50846. doi: 10. 3791/50846

Ono, Y., Masuda, S., Nam, H., Benezra, R., and Miyagoe-suzuki, Y. (2012). سلول های ماهواره ای با تقسیم آهسته، توانایی طولانی مدت خود نوسازی را در عضله بالغ حفظ می کنند. J. Cell Sci. 125، 1309-1317. doi: 10. 1242/jcs. 096198

پارک، Y. G.، مون، J. H.، و Kim، J. (2006). مطالعه مقایسه ای مرتب سازی سلول های فعال شده با مغناطیسی، سمیت سلولی و پیش آبکاری برای خالص سازی میوبلاست های انسانییونسی مد. ج 47:179. doi: 10. 3349/ymj. 2006. 47. 2. 179

پارکر ، M. H. ، Seale ، P. ، and Rudnicki ، M. A. (2003). با نگاهی به جنین: تعریف شبکه های رونویسی در میوژنز بزرگسالان. نات. روحانی ژنت. 4 ، 497-507. doi: 10. 1038/nrg1109

Qu ، Z. ، Balkir ، L. ، Van Deutekom ، J. C. T. ، Robbins ، P. D. ، Pruchnic ، R. ، and Huard ، J. (1998). توسعه رویکردها برای بهبود بقای سلول در درمان انتقال میوبلاست. J. Cell Biol. 142 ، 1257 1267. doi: 10. 1083/jcb. 142. 5. 1257

Rando ، T. A. ، and Blau ، H. M. (1994). تصفیه میوبلاست اولیه ماوس ، خصوصیات و پیوند برای ژن درمانی با واسطه سلول. J. Cell Biol. 125 ، 1275 1287. doi: 10. 1083/jcb. 125. 6. 1275

Relaix ، F. ، and Zammit ، P. S. (2012). سلولهای ماهواره ای برای بازسازی عضلات اسکلتی ضروری هستند: سلول موجود در Edge مرحله مرکز را برمی گرداند. توسعه 139 ، 2845-22856. doi: 10. 1242/dev. 069088

Richler ، C. ، and Yaffe ، D. (1970). ظرفیت های کشت و تقاضا در شرایط آزمایشگاهی رده های سلولی میوژنیک. دیافراگمبیول23 ، 1-22. doi: 10. 1016/s0012-1606 (70) 80004-80005

Sacco ، A. ، Doyoas ، R. ، Kraft ، P. ، Vitorovic ، S. ، and Blau ، H. M. (2008). خود نوسازی و گسترش سلولهای بنیادی عضلانی تک پیوند. طبیعت 456 ، 502-506. doi: 10. 1038/nature07384

Uezumi ، A. ، Fukada ، S. ، Yamamoto ، N. ، Takeda ، S. ، and Tsuchida ، K. (2010). اجداد مزانشیمی متمایز از سلولهای ماهواره ای در تشکیل سلول چربی خارج رحمی در عضله اسکلتی نقش دارند. نات. بیول سلولی. 12 ، 143-152. doi: 10. 1038/ncb2014

Uezumi ، A. ، Nakatani ، M. ، Ikemoto-uezumi ، M. ، Yamamoto ، N. ، Morita ، M. ، Yamaguchi ، A. ، et al.(2016). پروفایل پروتئین سطح سلول نشانگرهای متمایز سلول های پیش ساز در عضله اسکلتی انسان را مشخص می کند. نماینده سلول بنیادی 7 ، 263-2278. doi: 10. 1016/j. stemcr. 2016. 07. 004

Wagers ، A. J. ، and Conboy ، I. M. (2005). امضاهای سلولی و مولکولی بازسازی عضلات: مفاهیم فعلی و اختلاف نظرها در میوژنز بزرگسالان. سلول 122 ، 659-667. doi: 10. 1016/j. cell. 2005. 08. 021

Xu ، Z. ، Yu ، L. ، Lu ، H. ، Feng ، W. ، Chen ، L. ، Zhou ، J. ، et al.(2018). یک روش پیش از صفحه اصلاح شده برای جداسازی کارآمد و تکثیر سلولهای بنیادی مشتق از عضلات موش. سیتوتکنولوژی 70 ، 1671-1683. doi: 10. 1007/s10616-018-0262-260

Yin ، H. ، Price ، F. ، and Rudnicki ، M. A. (2013). سلولهای ماهواره ای و طاقچه سلولهای بنیادی عضلانی. فیزیول. وحی 93 ، 23-67. doi: 10. 1152/physrev. 00043. 2011

واژه های کلیدی: عضله اسکلتی ، سلول ماهواره ای ، سلول بنیادی عضلانی ، جداسازی ، قبل از آبکاری

استناد: Yoshioka K ، Kitajima Y ، Okazaki N ، Chiba K ، Yonekura A و Ono y (2020) یک روش پیش رو به ثمر برای جداسازی سلولهای بنیادی عضله با بازده بالا و از بافتهای عضلانی اسکلتی انسان/موش. جلو. سلول DEV. بیول8: 793. doi: 10. 3389/fcell. 2020. 00793

دریافت: 09 مارس 2020 ؛پذیرفته شده: 28 ژوئیه 2020 ؛منتشر شده: 13 اوت 2020.

So-ichiro Fukada ، دانشگاه اوزاکا ، ژاپن

Norio Motohashi ، مرکز ملی عصب شناسی و روانپزشکی ، ژاپن Maurilio Sampaolesi ، Ku Leuven ، بلژیک

کپی رایت © 2020 Yoshioka ، Kitajima ، Okazaki ، Chiba ، Yonekura و Ono. این یک مقاله با دسترسی آزاد است که تحت شرایط مجوز انتساب Creative Commons (CC توسط) توزیع شده است. استفاده ، توزیع یا تولید مثل در سایر انجمن ها مجاز است ، مشروط بر اینکه نویسنده اصلی (ها) و مالک (های) دارای حق چاپ (دارایی) اعتبار داشته باشند و انتشار اصلی در این ژورنال مطابق با عمل دانشگاهی پذیرفته شده استناد می شود. بدون استفاده ، توزیع یا تولید مثل مجاز است که این شرایط را رعایت نمی کند.